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孕停艽俳赴只种葡赴鲋场！b基因对肿瘤的抑制作用与转录因子（E－ 2F ）有关。E …2F 是一类激活转录作用的活性 蛋白，在G0、G1期，低磷酸化型的Rb蛋白与E－ 2F 结合成复合物，使E－ 2F 处于非活 化状态；在S期，Rb蛋白被磷酸化而与E－ 2F 解离，结合状态的E …2F 变成游离状态，细 胞立即进入增殖阶段。当Rb基因发生缺失或突变，丧失结合、抑制E …2F 的能力，于是细 胞增殖活跃，导致肿瘤发生。
（二）P53 基因 野生型P53蛋白在维持细胞正常生长、抑制恶性增殖中起着重要作用，P53基因时刻监控着 基因的完整性，一旦细胞DNA遭到损害，P53蛋白与相应基因的DNA部位结合，起特殊转录因子作用，活化P21基因转录，使细胞停滞于G1期；抑制解链酶活性；并与复制因子A相 互作用参与DNA的复制与修复；如果修复失败，P53蛋白即启动程序性死亡过程诱导细胞自 杀，阻止有癌变倾向突变细胞的生成，从而防止细胞恶变。 当P53发生突变后，不单失去野生型P53抑制肿瘤增殖的作用，而且突变本身又使该基因具 备癌基因功能。
六、生长因子 （一）概述 调节细胞生长与增殖的多肽类物质称为生长因子。 根据生长因子产生细胞与接受生长因子作用的细胞相互之间的关系，可概括为以下三种模 式： ①内分泌，生长因子从细胞分泌出来后，通过血液运输作用于远隔靶细胞。如：血小板源生 长因子源于血小板作用于结缔组织。 ②旁分泌，细胞分泌的生长因子作用于邻近的其他类型细胞，对合成、分泌该生长因子的自 身细胞不发生作用，因为它缺乏相应受体。 ③自分泌，生长因子作用于合成及分泌该生长因子的细胞本身。生长因子以后两种作用方式为主。 （二）生长因子的作用机制 生长因子由不同的细胞合成后分泌，作用于靶细胞上的相应受体，这些受体有的是位于细胞膜上，有的是位于细胞内部。位于膜表面的受体是跨膜的受体蛋白，包含具有酪氨酶活性的 胞内结构域。当生长因子与这类受体结合后，受体所包含的酪氨酸激酶被活化，使相关蛋白 磷酸化。另一些膜上的受体则通过胞内信息传递体系，产生相应的第二信使，后者使蛋白激 酶活化，活化的蛋白激酶同样可使胞内相关蛋白质磷酸化。这些被磷酸化的蛋白质再活化核 内的转录因子，引发基因转录，达到调节生长与分化的作用。 另一类生长因子受体定位于胞液。当生长因子与胞内相应的受体结合后，形成生长因子…受 体复合物，后者亦可进入细胞核活化相关基因促进细胞生长。
★ 基因诊断与基因治疗 考点： 基因诊断的定义及常用技术方法； 基因治疗的定义、采用方法和基本程序。 基因诊断的概念和特点。基因诊断的常用技术方法：常用方法有①核酸分子杂交技术，包括 限制性内切酶酶谱分析法、DNA限制性片段长度多态性（RFLP）分析、等位基因特异寡核 苷酸探针（ASO）杂交法。②PCR。③基因测序。 基因治疗的概念和常用方法：常用方法有基因矫正、基因置换、基因增补、基因失活、引入自杀基因。 难点： 基因诊断的方法及其原理，基因治疗载体的选择。
一、基因诊断 （一）基因诊断的概念和特点 所谓基因诊断就是利用现代分子生物学和分子遗传学的技术方法，直接检测基因结构及其表 达水平是否正常，从而对疾病作出诊断的方法。 基因诊断的特点：①以基因作为检查材料和探查目标，属于“病因诊断”，针对性强。②分子 杂交技术选用特定基因序列作为探针，具有很高的特异性。③分子杂交和聚合酶链反应都具 有放大效应，诊断灵敏度很高。④适用性强，诊断范围广，检测目标可为内源基因也可为外 源基因。
（二）基因诊断的常用技术方法 1。核酸分子杂交技术 以检测样本中是否存在与探针序列互补的同源核酸序列。常用有以下方法。 （1）限制性内切酶分析法。 此方法是利用限制性内切酶和特异性DNA探针来检测是否存 在基因变异。当待测DNA序列中发生突变时会导致某些限制性内切酶位点的改变，其特异 的限制性酶切片段的状态在电泳迁移率上也会随之改变，借此可作出分析诊断。 （2）DNA限制性片断长度多态性分析。 在人类基因组中，平均约200对碱基可发生一对变 异（称为中性突变），中性突变导致个体间核苷酸序列的差异，称为DNA多态性。不少 DNA多态性发生在限制性内切酶识别位点上，酶解该DNA片段就会产生长度不同的片断， 称为限制性片段长度多态性（RFLP）。RFLR按孟德尔方式遗传，在某一特定家族中，如果某 一致病基因与特异的多态性片断紧密连锁，就可用这一多态性片段为一种“遗传标志”，来判 断家庭成员或胎儿是否为致病基因的携带者。甲型血友病、囊性纤维病变和苯丙酮尿症等均 可借助这一方法得到诊断。 （3）等位基因特异寡核苷酸探针杂交法。遗传疾病的遗传基础是基因序列中发生一种或多 种突变。根据已知基因突变位点的核苷酸序列，人工合成两种寡核苷酸探针：一是相应于突 变基因碱基序列的寡核苷酸；二是相应于正常基因碱基序的寡核苷酸，用它们分别与受检者 DNA进行分子杂交。从而检测受检者基因是否发生突变，以及是否有新的突变类型。2。聚合酶链反应（PCR） PCR技术采用特异的引物，能特异地扩增出目的DNA片段。由于在基因顺序中突变区两侧 的碱基序列和正常基因仍然相同。因此。根据待测基因两端的DNA顺序设计出一对引物， 经PCR反应将目的基因片断扩增出来，即可进一步分析判断致病基因的存在与否，并了解其 变异的形式。 相同长度的单链DNA基因碱基序列不同，甚至单个碱基不同，都可能形成不同的空间构 象，从而在电泳时泳动速率不同。PCR产物变性后，经聚丙烯酰胺凝胶电泳，正常基因和变 异基因的迁移位置不同，借此可分析确定致病基因的存在，这就是PCR/单链构象多态性分 析。其他方法还有PCR/ASO法、PCR/RFLP法、PCR/限制性酶谱法。 3。基因测序 分离出患者的有关基因，测定出碱基排列顺序，找出其变异所在，这是最为确切的基因诊断 方法。
（三）基因诊断的应用 随着基因诊断方法学的不断改进更新，它已被广泛地应用于遗传病的诊断中。如对有遗传病 危险的胎儿在妊娠和产前诊断的，杜绝患儿出生。 基因诊断除用于细胞癌变机制的研究外，还可对肿瘤进行诊断、分类分型和愈后检测。 在感染性疾病的基因诊断中，不仅可以检出正在生长的病原体，也能检出潜伏的病原体，既 能确定既往感染，也能确定现行感染。对那些不容易外培养和不能在实验室安全培养（如立 克次氏体）的病原体，也可用基因诊断进行检测。 在传染性流行病中，采用基因诊断分析同血清型中不同地域、不同年份病原体分离株的同源 性和变异性，有助于研究病原体遗传变异趋势，指导暴发流行的预测。 基因诊断在判断个体对某种重大疾病的易感性方面也起着重要作用。 基因诊断在器官移植组织配型中的应用也日益受到重视。 基因诊断在法医学中应用主要针对人类DNA遗传差异进行个体识别和亲子鉴定。
二、基因治疗 （一）基因治疗的概念 基因治疗是用正常的基因整合入细胞，以校正和置换致病基因的一种治疗方法。目前从广义 上来讲，将某种遗传物质转移到患者细胞内，使其体内发挥作用，以达到治疗疾病目的方法，也谓之基因治疗。 目前基因治疗所采用的方法基本上可分为以下几种：
1。基因矫正 基因矫正指将致病基因的异常碱基进行纠正，而正常部分予以保留。 2。基因置换 基因置换就是用正常基因通过体内基因同源重组，原位替换病变细胞内的致病基因，使细胞 内的DNA完全恢复正常状态。 3。基因增补 基因增补指将目的基因导入病变细胞或其他细胞，不去除异常基因，而是通过目的基因的非 定点整合，使其表达产物补偿缺陷基因的功能或使原有的功能得到加强。目前基因治疗多采 用此种方式。 4。基因失活 早期一般是指反义核酸技术。它是将特定的反义核酸，包括反义RNA，反义DNA和核酶导 入细胞，在翻译和转录水平阻断某些基因的异常表达。近年来又有反基因策略、肽核酸、基 因去除和RNA干扰技术。
（二）基因治疗的基本程序 1。治疗性基因的选择 选择对疾病有治疗作用的特定目的基因是基因治疗的首要问题。对于单基因缺陷的遗传病而 言，其野生型基因即可被用于基因治疗，如选用腺苷脱氨酶（ADA）基因治疗ADA缺陷导致 的重症联合免疫缺陷综合症。 2。基因载体的选择 有病毒载体有非病毒体两类，多用病毒载体，如逆转录病毒、腺病毒和腺相关病毒载体。3。靶细胞的选择 根据受体细胞种类的不同，基因治疗分为体细胞的基因治疗和生殖细胞的基因治疗两大类。4。基因转移 将基因导入哺乳动细胞的方法有两种：一是非病毒介导的基因转移；二是病毒介导的基因转移。非病毒介导的基因转移方法包括物理的和化学的方法等。物理方法有显微注射、电穿孔、DNA直接注射和基因枪技术等。化学方法有磷酸钙沉淀法、DEAE…葡聚糖法、脂质体 介导的基因转移等。 导入基因的方式有两种：一种是间接体内疗法，即在体外将外源基因导入靶细胞内，再将这 种基因修饰过的细胞回输病人体内，使带有外源基因的细胞在体内表达相应产物，以达到治 疗的目的。其基本过程类似于自体组织细胞移植。另一种直接体内疗法，即将外源基因直接 导人体内有关的组织器官，使其进入相应的细胞并进行表达。 5。外源基因表达筛检 利用载体中的标记基因对转染细胞进行筛选，只有稳定表达外源基因的细胞在病人体内才能 发挥治疗效应。 6。回输体内 将治疗性基因修饰的细胞以不同的方式回输体内以发挥治疗效果。
多肽链中氨基酸序列分析
a。分析纯化蛋白质的氨基酸残基组成
（蛋白质水解为个别氨基酸，测各氨基酸的量及在蛋白质中的百分组成）
↓
测定肽链头、尾的氨基酸残基
二硝基氟苯法（DNP法）
头端 尾端 羧肽酶Ａ、Ｂ、Ｃ法等
丹酰氯法
↓
水解肽链，分别分析
胰凝乳蛋白酶（糜蛋白酶）法：水解芳香族氨基酸的羧基侧肽键
胰蛋白酶法：水解赖氨酸、精氨酸的羧基侧肽键
溴化脯法：水解蛋氨酸羧基侧的肽键
↓
Edman降解法测定各肽段的氨基酸顺序
（氨基末端氨基酸的游离α…氨基与异硫氰酸苯酯反应形成衍生物，用层析法鉴定氨基酸种类）
b。通过核酸推演氨基酸序列。
一、糖酵解
１、过程：糖酵解过程中包含两个底物水平磷酸化：一为1；3…二磷酸甘油酸转变为3…磷酸甘油酸；二为磷酸烯醇式丙酮酸转变为丙酮酸。
２、调节
１）６－磷酸果糖激酶…1 变构抑制剂：ATP、柠檬酸
变构激活剂：AMP、ADP、1，6…双磷酸果糖（产物反馈激，比较少见）和2，6…双磷酸果糖（最强的激活剂）。
２）丙酮酸激酶 变构抑制剂：ATP 、肝内的丙氨酸 变构激活剂：1，6…双磷酸果糖
３）葡萄糖激酶 变构抑制剂：长链脂酰辅酶A
注：此项无需死记硬背，理解基础上记忆是很容易的，如知道糖酵解是产生能量的，那么有ATP等能量形式存在，则可抑制该反应，以利节能，上述的柠檬酸经三羧酸循环也是可以产生能量的，因此也起抑制作用；产物一般来说是反馈抑制的；但也有特殊，如上述的1，6…双磷酸果糖。特殊的需要记忆，只属少数。以下类同。关于共价修饰的调节，只需记住几个特殊的即可，下面章节提及。
（1）糖原 1…磷酸葡萄糖
（2）葡萄糖 己糖激酶 6…磷酸葡萄糖 6…磷酸果糖6…磷酸果糖…1…激酶
ATP ADP ATP ADP
磷酸二羟丙酮
1；6…二磷酸果糖
3…磷酸甘油醛 1；3…二磷酸甘油酸
NAD＋ NADH＋H＋
3…磷酸甘油酸 2…磷酸甘油酸 磷酸烯醇式丙酮酸 丙酮酸激酶
ADP ATP ADP ATP
丙酮酸 乳酸
NADH＋H＋ NAD＋
注：红色表示该酶为该反应的限速酶；蓝色ATP表示消耗，红色ATP和NADH等表示生成的能量或可以转变为能量的物质。以下类同。
３、生理意义
１）迅速提供能量，尤其对肌肉收缩更为重要。若反应按（１）进行，可净生成３分子ATP，若反应按（２）进行，可净生成２分子ATP；另外，酵解过程中生成的２个NADH在有氧条件下经电子传递链，发生氧化磷酸化，可生成更多的ATP，但在缺氧条件下丙酮酸转化为乳酸将消耗NADH，无NADH净生成。
２）成熟红细胞完全依赖糖酵解供能，神经、白细胞、骨髓等代谢极为活跃，即使不缺氧也常由糖酵解提供部分能量。
３）红细胞内1，3…二磷酸甘油酸转变成的2，３…二磷酸甘油酸可与血红蛋白结合，使氧气与血红蛋白结合力下降，释放氧气。
４）肌肉中产生的乳酸、丙氨酸（由丙酮酸转变）在肝脏中能作为糖异生的原料，生成葡萄糖。
☆丙酮酸的去路：
①丙酮酸脱氢酶系作用下，形成乙酰…CoA；
②丙酮酸羧化酶作用下，形成草酰乙酸；
③乳酸脱氢酶作用下，生成乳酸；
④丙酮酸脱羧酶及乙醇脱氢酶作用下，生成乙醇；
其中③和 ④是在无氧条件下糖酵解继续进行的反应，使NADH在被氧化为NAD＋。
葡萄糖分子的第3，4位碳原子形成了2分子3…磷酸甘油醛的醛基碳原子，葡萄糖分子的第1，6位碳原子形成了3…磷酸甘油醛的第3位碳原子，第2，5位碳原子形成3…磷酸甘油醛的第2位碳原子。
４、乳酸循环乳酸循环 是由于肝内糖异生活跃，又有葡萄糖…6…磷酸酶可水解6…磷酸葡萄糖，释出葡萄糖。肌肉除糖异生活性低外，又没有葡萄糖…6…磷酸酶。 生理意义：避免损失乳酸以及防止因乳酸堆积引起酸中毒。
葡萄糖 葡萄糖 葡萄糖
糖 糖
异 酵
生 解
途 途
径 径
丙酮酸 丙酮酸
乳酸 乳酸 乳酸
（肝） （血液） （肌肉）
二、糖有氧氧化 １、过程
1）、经糖酵解过程生成丙酮酸
2）、丙酮酸 丙酮酸脱氢酶复合体 乙酰辅酶A
NAD＋ NADH＋H＋
限速酶的辅酶有：TPP﹑FAD﹑NAD＋﹑CoA及硫辛酸
3）、三羧酸循环
草酰乙酸＋乙酰辅酶A 柠檬酸合成酶 柠檬酸 异柠檬酸 异柠檬酸脱氢酶
NAD＋ NADH＋H＋
α…酮戊二酸 α…酮戊二酸脱氢酶复合体 琥珀酸酰CoA 琥珀酸
NAD＋ NADH＋H＋ GDP GTP
延胡索酸 苹果酸 草酰乙酸
FAD FADH2 NAD＋ NADH＋H＋
三羧酸循环中限速酶α…酮戊二酸脱氢酶复合体的辅酶与丙酮酸脱氢酶复合体的辅酶同。三羧酸循环中有一个底物水平磷酸化，即琥珀酰COA转变成琥珀酸，生成GTP；加上糖酵解过程中的两个，本书中共三个底物水平磷酸化。
２、调节
１）丙酮酸脱氢酶复合体 抑制：乙酰辅酶A、NADH、ATP 激活：AMP、钙离子
２）异柠檬酸脱氢酶和α…酮戊二酸脱氢酶 NADH、ATP反馈抑制
琥珀酸脱氢酶是柠檬酸循环中唯一嵌入线粒体内膜中的酶，其它酶都处于线粒体基质中。
三羧酸循环的调控—�