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2．仔细核对标本采集日期和送检日期。延误的标本，一般情况下不接收。通常用于
细菌学检验的标本的存放不要超过24h。而病毒检测的标本可于4℃存放2～3天。联系临
床对于非侵害性方式获取的标本（如尿、痰、咽拭子等标本）要求重新采集送检。对于侵
害性操作获取的标本（穿刺液、体液或组织）需与采集此标本的医生商量之后，方可接收
检测，并要在报告上注明情况，将其记录存档。
3．检查送检容器是否完整，有无破损或渗漏等情况，若有则不予接收。告知送检者
并要求重新送检。
4．标本储存、运送方式不当，不予接收。特别应注意厌氧培养标本的送检方式。及
某些对环境温度敏感的病原体的送检方式，联系送检者，告知实验要求，说明其不同之
处。要求其再送检符合实验要求的标本。
5．明显被污染的标本不予接收。
6．标本量明显不足的标本，不予接收。标本量不够会导致假阴性结果。如标本不易
取得，量少的标本要在采集后的15～30min内送检。
7．同一天申请做同一实验的重复送检标本（血培养除外），不予接收。与送检者联系
并说明标本重复不予处理。在报告单上予以注明。
8．对于烈性传染病标本的采集和运送应严格执行相关规定，要有完善的防护措施，
按规定包裹及冷藏，附有详细的采样及送检纪录，由专人护送。
此外，也有例外的情况。即使标本质量不符合要求也必须要做检测。例如取材特别困
难、储存运送条件简陋等。
三、检查方法
病原体试验检查方法主要有以下几类。
（一）直接显微镜检查
病原体的直接显微镜检测是病原体检验中极为重要的基本方法之一，包括不染色标本
检查法和染色标本检查法。不染色标本直接镜检法，主要用于检查生活状态下细菌的动力
及运动状况，常用的方法有压滴法和悬滴法，在不染色状态下借助暗视野显微镜或相差显
微镜观察病原菌的生长、运动方式、螺旋体的形态和运动。染色法标本检查法是将标本直
接涂片、干燥、固定后染色，或经离心浓缩集菌涂片染色，置光学显微镜下观察细菌的形
态、染色性或观察宿主细胞内包涵体的特征。
无菌体液的直接镜检对病原体诊断具有一定意义，对正常菌群寄居腔道的分泌物涂片
镜检可提示进一步检查的步骤、采取的方法和确定分离鉴定病原体所需培养基。由于临床
标本中常含有一定浓度的抗菌物质，以致分离培养可为阴性，此时的镜检所见往往可能在
诊断上起重要作用。荧光显微镜检查用于标本经荧光染色后直接检出某些病原微生物如结
核分枝杆菌、麻风分枝杆菌和白喉棒状杆菌等，如结合标记免疫技术（荧光抗体）可检查
相应的抗原，用形态学和免疫学相结合的方法可特异性地检测某些病原微生物的存在。电
镜检查虽不常规应用于临床，但对某些病毒感染却有确诊的价值，如婴幼儿急性胃肠炎腹
泻粪便电镜下查见车轮状的双层衣壳病毒颗粒即可诊断为轮状病毒引起的胃肠炎。
（二）病原体特异性抗原检查
用已知抗体检测患者血清及其他体液中的待测抗原，借助免疫荧光技术、酶联免疫技
术、化学发光技术、胶乳凝集试验、对流免疫电泳等技术检测标本中未知的病原体抗原，
其诊断价值常以标本不同而各异。标本中如果存在多种正常寄居微生物，可因交叉抗原的
存在而不能肯定诊断。使用特异性好、效价高的单克隆抗体只能检测在活细胞内增殖的病
毒或立克次体、衣原体，在设有严格的对照和排除试验时，阳性结果可作出准确的病原学
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诊断。检测细菌不同的抗原构造，还可分析细菌的菌群和血清型，如沙门菌属、志贺菌属
和霍乱弧菌等。从临床标本中直接检测病原体抗原，简便快速，有较高的敏感性，适用于
多种感染性疾病的早期快速诊断。在使用抗生素治疗前，显微镜检查和培养结果均为阴性
时，采用这类试验对诊断有较大的帮助。
蛋白质芯片（protein chips）是近年来随着蛋白质组学的发展而出现的蛋白质及多肽
分析的新技术。此类芯片是按特定排列方式在很小的表面积上集成多种蛋白质活性分子
（配基），利用微量生理或生物采样技术，同时检测相应的抗体、抗原及蛋白质。该技术具
有平行化、微型化和高通量等特点。利用蛋白质芯片技术可以同时对多种病原体特异性抗
原进行检测，目前用于检测S AlRS病人血清的蛋白质芯片已研制成功。
（三）病原体核酸检查
目前临床常用的核酸检测技术主要有聚合酶链反应（poly：met孙e chain rea（：tion，PCR）
和核酸探针杂交技术。PCR技术是一种体外基因扩增技术，是利用DNA聚合酶介导一系
列循环反应，对来自基因组DNA的信号进行放大，然后将扩增的DNA片段进行特异性
鉴定，从而检出目的基因。利用这一技术，可在短时间内对标本中微生物的每一个基因扩
增至几百万倍，检出极其微量的微生物DNA，具有很高的敏感性和特异性。PcR技术对
结核和麻风分枝杆菌、乙型肝炎病毒、丙型和戊型肝炎病毒、HIv、巨细胞病毒、轮状病
毒等的临床检测表明，其方法简便、敏感性好、特异性也强。核酸探针杂交技术可检测临
床标本中的许多细菌和病毒，但其敏感性尚不够满意。如果PcR技术与核酸探针杂交技
术结合起来，可使检测的敏感性大为提高，特异性亦可大大增强。
近年来发展起来的实时荧光定量PcR技术（real—time PcR）是通过始点定量和荧光
检测系统实时监测累积荧光强度而实现核酸定量的一种技术，具有全封闭单管扩增、灵敏
度高、特异性强、线性关系好、操作简单、无扩增后处理步骤等优点，目前已经应用于临
床多种病原体的快速检测。
基因芯片技术（gene chip或DNA microarray）是近年来发展快速的前沿技术，其原
理是将大量核酸片段（寡核苷酸、PNA、cDNA、基因组DNA）以预先设计的方式固定
在载玻片、尼龙膜和纤维素膜等载体上组成密集分子阵列，与荧光素或其他方式标记的样
品进行杂交，通过检测杂交信号的强弱进而判断样品中靶分子的有无和数量。该技术具有
高通量、自动化程度高、快速、样品用量少、灵敏度高、特异性强、污染少等特点。病原
微生物的16S rDNA及23S rDNA序列近几年被作为一个较理想的基因分类靶序列，其在
进化压力下保持了高度的保守性，同时又具有一定的变异性，基因芯片技术通常利用病原
微生物的这一分子生物学特性，实现多样本多病原微生物的同时检测。
病原体核酸检测不仅适用于目前尚不能分离培养或很难分离培养的微生物，而且适用
于检测核酸变异的病原微生物。变异是病原微生物适应环境和维持生存的一种重要方式。
不同物种变异速率不一，病毒是变异率比较高的微生物。病毒变异不仅对病毒感染性疾病
的治疗、预后构成不利，同时还影响到病毒感染的正确诊断。基因芯片技术和探针标记技
术成为解决这一问题的可能途径。它们不仅能对病毒进行基因分型，还能检测病毒可能的
耐药基因区域，预测其发生耐药的可能性和耐药程度。随着分子生物学技术的不断发展，
检测试剂盒的标准化和商品化，操作更简便易行，基因芯片技术和探针标记技术无疑将会
成为感染性疾病快速诊断的重要手段之一。
（四）病原体的分离培养和鉴定
1．细菌感染性疾病病原体的分离培养 分离培养是微生物学检验中确诊的关键步骤。
根据临床症状、体征和镜下检查特征作出病原学初步诊断，选用最合适的培养方法，主要
是选择适当的培养基、接种前的标本处理和确定孵育条件，然后根据菌落性状（大小、色
第九章临床常见病原体检测
泽、气味、边缘、光滑度、色素、溶血情况等）和细菌的形态、染色性，检测细菌生化反
应结果和血清学实验、动物接种实验（白喉杆菌），对分离菌作出鉴定，也可借助于微量
鉴定系统快速简便鉴定分离菌。在鉴定细菌的同时，需做抗生素药物敏感试验。
2．不能人工培养的病原体感染性疾病 将标本接种易感动物、鸡胚或行细胞培养。
接种动物后，可根据动物感染范围、动物发病情况及潜伏期，初步推测为某种病原体。接
种于鸡胚的病毒，根据不同接种途径的敏感性及所形成的特殊病灶，有助于初步鉴定。细
胞培养的病毒，可依据细胞病变的特点或红细胞吸附、干扰现象、血凝性质等缩小病毒的
鉴定范围，最后用血清学方法作最后鉴定。
（五）血清学实验
用已知病原体的抗原检测患者血清中相应抗体以诊断感染性疾病。人体感染病原体后
经过一定时间产生特异性抗体。这种抗体在体内可维持数月或更长时间，因而检测抗体不
仅可用于现症诊断，而且还是疾病追溯性调查的一种方法。血清学诊断对于某些病原体不
能培养或难以培养的疾病，可以提供诊断的依据，但是，抗体检出最早也需在感染4～5天
以后，一般在病程2周后效价才逐渐增高，因而它不适于疾病的早期诊断。在作血清学诊
断时，一般要在病程早期和晚期分别采血清标本2～3份检查，如抗体效价在病程中呈4倍
以上增长者有现症诊断价值。若每次抗体效价无变化，则可能是因为隐性感染或回忆反应
所致，而不能做现症感染的诊断。单份血清一般诊断意义不大，除非检测IgM。病人血清
内IgM的检测有重要意义，不仅可做早期诊断，而且可区分原发性感染和复发性感染，
前者急性期血清检出IgM，而后者为IgG。常用的血清学检测方法有凝集试验、沉淀试
验、补体结合试验、间接免疫荧光技术、放射免疫测定、酶联免疫吸附试验等。血清学诊
断试验的价值常用敏感性、特异性和预测值来评价。临床医生必须合理选择试验项目达到
确诊某一疾病、排除某一疾病或监测疾病治疗的效果（表4—9—1）。
表4—9—1 病原体检测方法、判断和速度
第二节 病原体耐药…陛检测
抗菌药物是目前临床使用最为广泛的药物，它的发现、研制和临床应用是现代医学史
上的重要里程碑，使绝大多数微生物感染，尤其是细菌感染成为可治性疾病。但抗微生物
药物的广泛使用所造成的“抗生素压力”（antihiotic pressure）也使原来占优势的敏感菌
株被抑制和杀灭，原来是少数劣势的固有耐药菌株或诱导出的获得耐药菌株则繁衍成抗菌
药物主要使用环境（如医院、诊所内）的优势菌株，使临床医学在感染控制上面临严重的
挑战。了解耐药发生机制和耐药性监测，熟悉常见耐药菌株的耐药特点，是临床医学生的
一个重要任务。
一、耐药性及其发生机制
（一）耐药病原体
目前临床感染的病原微生物以革兰阴性菌居多（约占六成），主要是铜绿假单胞菌、
大肠埃希菌、克雷伯菌和肠杆菌属细菌等，主要耐药类型有以p一内酰胺酶介导的耐p一内
酰胺类抗生素的革兰阴性杆菌；质粒介导的产超广谱B一内酰胺酶（extra—spect…rum bet？a
lactamase，ESBL）的肺炎克雷伯菌、大肠埃希菌等；染色体编码产生工类8一内酰胺酶的
阴沟肠杆菌和产气肠杆菌等；另外多重耐药的铜绿假单胞菌、嗜麦芽窄食单胞菌和不动杆
菌属细菌等都已成为临床上感染性疾病治疗的棘手问题。革兰阳性菌引起的感染约占三
成，以葡萄球菌（金黄色葡萄球菌和血浆凝固酶阴性的葡萄球菌）和肠球菌为主，重要的
耐药菌株有耐甲氧西林葡萄球菌（methecillin resistant staphy．10cct】s，MRs）、耐青霉素肺
炎链球菌（penic川in reSl’stant streptc）COCCIJs pnetlm（）nia，PRSP）、耐万古霉素肠球菌（va—
comycin resistant enteroc（）CCLts，VRE）和高耐氨基糖苷类抗生素的肠球菌等。不仅细菌可
产生耐药，病毒也出现了耐药病毒株，导致抗病毒治疗逃逸现象发生。如HBV发生突变，
对核苷类似物药物（如lamivudine拉米夫定和famciclovir华美可维等）产生耐药。
（二）耐药机制
对某种抗菌药物敏感的细菌变成对该药物耐受的变异称为耐药性变异。细菌的耐药性
变异已成为当今医学的重要问题。细菌耐药性的获得可以通过细菌染色体耐药基因的突
变、耐药质粒的转移和转座子的插入，使细菌产生一些酶类（灭活酶或钝化酶）和多肽类
物质，通过下述几种机制导致细菌耐药：
1．细菌水平和垂直传播耐药基因的整合子系统 整合子（integrOil）是捕获外源基因
并使之转变为功能性基因的表达单位，通过转座子和接合质粒在细菌中传播的遗传物质。
整合子的基本结构由1个编码整合酶（integrase）的IntI基因、2个基因重组位点attI和
attc、启动子和耐药基因盒组成。目前已确定有60多个耐药基因盒，常见的有：①aad基
因盒：编码氨基糖苷类的耐药性。②dfr基因盒：编码甲氧磺胺嘧啶类的耐药。③编码0一
内酰胺酶和超广谱p～内酰胺酶。④其他基因盒：cat基因编码对氯霉素的耐药；aac：基因
编码对氨基糖苷类的耐药；aar基因编码对利福平的耐药；ere基因编码对红霉素的耐药。
2．产生灭活抗生素的水解酶和钝化酶等 常见的有：①ESBI。s：由质粒介导的、能赋
予细菌对多种p一内酰胺类抗生素耐药，它主要由革兰阴性杆菌产生。②AnlpO p一内酰胺
酶（AmpC p—lactamases）：是革兰阴性杆菌产生的不被克拉维酸抑制的丝氨酸头孢菌素
酶组成的一个酶家族，几乎对所有的口一内酰胺类药物耐药。③碳青霉烯酶：碳青霉烯酶
主要水解碳青霉烯类抗生素，表现为对碳青霉烯类抗生素高度耐药。按Ambler分子分类
为A、B、D 3类酶，A类酶见于一些肠杆菌科细菌，D类酶仅见于不动杆菌；B类酶为金
属酶，见于铜绿假单胞菌、不动杆菌、肠杆菌科细菌。④氨基糖苷类钝化酶：是细菌对氨
基糖苷类抗生素获得性耐药的主要机制，通过质粒介导能使氨基糖苷类抗生素失活。
3．细菌抗生素作用靶位的改变靶位结构的改变，是引起细菌耐药的一个重要因素。
如MRS是由于染色体上？…Fie（：A基因编码产生低亲和力的青霉素结合蛋白（PBP2a），以至
青霉素不能抑制细菌细胞壁的合成；VRE的耐药是由于细菌染色体的改变，编码产生的
酶导致与万古霉素作用的靶位改变；大肠埃希菌DNA拓扑异构酶Ⅱ的gryA基因突变，
可造成对喹诺酮类中所有药物交叉耐药等。
4．细菌膜外排泵出系统 细菌依靠主动外排泵出机制来减少细菌内药物浓度，如铜
绿假单胞菌有3套外排泵出系统，MexAB—oprM、MexCD—oprJ、．MexEF—oprN等。
5．细菌生物膜的形成 细菌生物膜（biofilm，BF）是指附着于有生命或无生命物体
第九章 临床常见病原体检测
表面被细菌胞外大分子包裹的有组织的细菌群体。与浮游菌相比，生物膜中细菌对抗生索
的耐药性可提高lo～1000倍，其耐药性主要取决于其多细胞结构：①生物膜中的胞外多
糖起屏障作用，限制抗生素分子向细菌运输。②生物膜中微环境的不同可影响抗生素的活
性。③诱导细菌产生特异性表型。④多菌种的协同作用。具有生物膜的细菌多见于铜绿假
单胞菌、金黄色葡萄球菌、肠球菌、变异链球菌。
细菌的多种耐药机制可协同作用，导致多耐药菌株的出现。
二、检查项目、结果和临床应用
常用的检查细菌是否对药物耐药的方法有定性测定的纸片扩散法、定量测定的稀释法
和E试验法。对某些特定耐药菌株的检测除药物敏感试验外还要附加特殊的酶检测试验、
基因检测等方法。
（一）药物敏感试验
1．K—B纸片琼脂扩散法（Kirby—Bauer disc agar diffusion method） 世界卫生组织
推荐的标准纸片扩散法，是由Kirby和Bauer建立的。将含有定量抗菌药物的纸片贴
在接种有测试菌的M—H琼脂平板上置3 5℃孵育16～18h。用游标卡尺量取纸片周
围透明抑菌圈的直径，参照CLSI（Clinical and Laboratory Standard Institute）标准判读
结果，按敏感（susceptible，S）、中度敏感（intermediate，I）、耐药（resistant，R）
报告。S：测试菌能被测定药物常规剂量给药后在体内达到的血药�